细胞油红o染色的操作步骤
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细胞油红O染色的操作步骤 点击次数:348 发布时间:2011-4-1 1、10%中性甲醛的配制 材料:中性甲醛(多聚甲醛) 密封瓶 称取1g中性甲醛粉末,加入10ml的三蒸水中,密封,在60度水浴中过夜才能溶解。 配好的溶液1个星期内有效,最好4度保存。 2、染色液的配制 材料:油红染料 棕色可密封瓶 异丙醇 研钵 漏斗 定性滤纸 称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉,溶于少量异丙醇中,然后加异丙醇至100ml, 棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4℃保存,为储存液,可长期保存。用时取6ml加三 蒸水4ml混匀,定性滤纸过滤,稀释后数小时内用完。 3、培养载体 3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品,hoechst33342染核的话,塑 料板自发荧光也为蓝色,必须考虑。 4、.染色对象 间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。 5、注意事项: 脂肪油红染色,有的是动物/人体脂肪组织切片,或细胞爬片。各有操作差异。以下 是各论坛方法小结,不全。 (1).完全成熟饱满的脂肪细胞,容易破裂,脂滴泄漏,所以压片,切片都要考虑到这 个问题。 (2).细胞爬片细胞溶液脱落,特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。 (3).如果做脂肪组织冰冻切片,冰冻温度比普通要低,切片厚度加厚。 6、染色步骤: (1) 先小心轻缓倒去培养夜。 (2) 用pbs轻缓漂洗(不洗没问题)。 (3)加10%中性甲醛固定30min(实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可)。 固定的是细胞膜。 (4) 稀释油红储存液,油红:去离子水=3:2,滤纸过滤,室温放置10min(除去一些 杂质,染色结果更清晰)。 (5)染色10min左右,加的体积覆盖住板底即可,如6孔加1.5ml,24孔加0.5- 1ml(实际染色时间1小时都可以)。 (6)脱色,用75%酒精/60%异丙醇漂洗,除去多余的染料(实际用其他平衡液洗也没问 题,背景并不会残留多少)。 (7) 复染,淡苏木染色1/5分钟,pbs漂洗(这一步不做也可,看试验需要,并且苏 木素会把胞浆染红,如要显示核, hoechst33342也可以,浓度5微克/毫升染10分 钟即可把核染上)。 (8)甘油明胶封片(封片后可长期保存)。 (9)显微镜观察。 三、显示脂类的油红法: (1)操作步骤: 1、福尔马林固定后的恒冷箱切片附贴于载片上或游离切片,厚 5-10nm, 2、60%异丙醇稍洗切片, 3、油红 O 液染 5-15min, 4、60%异丙醇洗去多余染液, 5、自来水洗, 6、苏木素染细胞核 2min, 7、自来水洗,如果需要可分化, 8、水洗至细胞核蓝化 5-10min, 9、擦去多余水分,甘油明胶封固。 结果:脂类物质显示红色,细胞核显示蓝色。(II)试剂的配制: 油红 o(oil red o) 0.5g 异丙醇(isopropanot) 100ml 将异丙醇放入三角烧瓶,再加入油红 O,于水浴中慢慢加热使之溶解,待至完全溶解 后取出,冷却至室温后,过滤,装于棕色小磨沙口瓶保存,临用前取 6ml 加蒸馏水 4ml, 混合后静置 10min 后过滤,染色时间 5-15min。
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